Skip to content
3 tygodnie ago

610 words

Specyficzność wiązania wykazano w doświadczeniach kompetycyjnych, które wykazały utratę wiązania z dodatkiem 400-krotnego nadmiarem molowym specyficznego nieznakowanego oligonukleotydu (Figura 3B, ścieżka 4). Nie uzyskano wiązania, gdy jako kontrolę negatywną zastosowano oligonukleotyd odpowiadający regionowi promotora GAPDH (Figura 3B, ścieżki 11 i 12). Aby zidentyfikować region CBX7 wymagany do wiązania promotora CCNE1, przeprowadziliśmy ten sam eksperyment z dwoma rekombinowanymi zmutowanymi formami białka CBX7: jeden zawierający tylko chromodomenę (GST-CBX7-CHROMO) i inny pozbawiony chromodomen (GST-CBX7-NO CHROMO). Tylko GST-CBX7-CHROMO specyficznie wiąże się z promotorem CCNE1 (Figura 3B, ścieżki 5. 10), co wskazuje, że białko CBX7 jest zdolne do wiązania promotora CCNE1 in vitro przez jego chromodomenę. Następnie ocenialiśmy, czy białko CBX7 może wiązać się z ludzkim regionem promotora CCNE1, w tym E-box, wykonując testy ChIP. Komórki HEK 293 przejściowo transfekowano wektorem ekspresyjnym znakowanym CBX7 lub pustym wektorem. Następnie komórki usieciowano, a kompleksy chromatyny DNA poddano IP z przeciwciałami anty-HA lub IgG. Chromatynę IP następnie analizowano za pomocą ilościowego PCR (qPCR), stosując startery obejmujące region ludzkiego promotora CCNE1 (od około 850 do około 700 bp powyżej TSS) pokrywające region E-box. Jak pokazano na Figurze 3C, CBX7 znakowany HA znakował co-IP z promotorem CCNE1 w komórkach transfekowanych CBX7. Co więcej, CBX7 wiąże się również z CDH1 i CDKN2A, które wcześniej zidentyfikowano jako promotory (12, 20). Odwrotnie, nie zaobserwowano amplifikacji osadów anty-IgG i gdy zastosowano startery dla promotora GAPDH, wskazujące na specyficzność wiązania CBX7 z promotorem CCNE1. Te same wyniki uzyskano, gdy przeprowadziliśmy testy ChIP na Cbx7 + / + i Cbx7. /. MEF (Figura 3D) i tkanki płucne (dodatkowa Figura 3), które również wskazują, że endogenne białko CBX7 było zdolne do wiązania promotora CCNE1. Ponadto wiązanie Hdac2 do promotora Ccne1 było zmniejszone w Cbx7a / p. w porównaniu z komórkami Cbx7 + / + (Figura 3E), co wskazuje, że obecność Cbx7 sprzyja wiązaniu Hdac2 z promotorem Ccne1. Na koniec, w celu oceny konsekwencji funkcjonalnych wiązania CBX7 z promotorem CCNE1, wykazaliśmy, że CBX7 w sposób zależny od dawki zmniejsza aktywność transkrypcyjną promotora CCNE1 (Figura 3F). HMGA1 wypiera kompleks HDAC2 / CBX7 z promotora CCNE1. Wcześniej wykazaliśmy, że ekspresja białek HMGA zwiększa aktywność E2F poprzez przesunięcie HDAC z promotorów reagujących na E2F, w tym CCNE1 (21). Dlatego postawiliśmy hipotezę, że CBX7 wpływa na ekspresję CCNE1 przez interakcję z HMGA1, a następnie antagonizuje jego aktywność. Aby przetestować tę hipotezę, przejściowo transfekowaliśmy komórki HEK 293 konstruktami ekspresyjnymi CBX7 i HMGA1b, poddawano ekstraktom białek IP z przeciwciałami anty-CBX7 lub anty-HMGA1 i poddawano je immunoblottingowi z przeciwciałami odwrotnymi. Jak pokazano na Figurze 4A, koekspresja CBX7 i HMGA1b dała odwrotny ko-adres IP 2 białek. Co-IP przeprowadzono w obecności bromku etydyny, aby wykluczyć, że ko-IP CBX7 i HMGA1b jest zależny od zanieczyszczającego DNA. Ten sam wynik uzyskano, gdy przeprowadzono ko-IP z białkami endogennymi wyekstrahowanymi z zarodków myszy WT (Figura 4B). Odwrotnie, nie wykryto interakcji, gdy użyto niespecyficznych IgG (Figura 4, A i B). Aby zweryfikować tę interakcję, przeprowadziliśmy test pulsacyjny z użyciem rekombinowanego białka GST-CBX7; jak pokazano na figurze 4C, GST-CBX7, ale nie GST, był w stanie ściągnąć HMGA1b. Następnie, ze względu na zdolność HMGA1b do interakcji z CBX7 (Figura 4) i CBX7 do interakcji z HDAC2 (12), badaliśmy, czy fizyczne interakcje między CBX7 i HDAC2 lub HMGA1b mają miejsce w promotorze CCNE1.
[patrz też: penire plus opinie, płatki jaglane właściwości, g1 nysa ]

0 thoughts on “sanus szczecin”

  1. [..] odnosnik do informacji w naukowej publikacji odnosnie: odszkodowania powypadkowe[…]