Skip to content

Przeciwciała przeciwko proteazie rozszczepiającej czynnik von Willebranda w ostrym zakrzepowym trombocytopenicznym Purpura cd

1 miesiąc ago

494 words

Stężenie czynnika von Willebranda oznaczono za pomocą testu immunoenzymatycznego, jak opisano wcześniej. Test aktywności proteazy
Test aktywności proteazy rozszczepiającej czynnik von Willebranda w osoczu oparto na generowaniu, z oczyszczonego czynnika von Willebranda, dimerów fragmentów 176-kd i 140-kd, które pojawiły się odpowiednio jako pasma 350-kd i 200-kD, w elektroforezie na żelu sodowym z dodecylosiarczanem i poliakryloamidem.15 Próbki osocza rozcieńczono 1: 3 buforem TRIS z roztworem soli zawierającym 50 mmol TRIS na litr i 50 mmol chlorku sodu na litr (pH 8,0) w obecności lub przy braku 5 mmol EDTA na litr. Czynnik Von Willebranda dodano do badanych próbek w rozcieńczeniu 1:10. Po 60-minutowej inkubacji w 37 ° C reakcję zakończono przez dodanie rozcieńczenia 1: 5 buforu zawierającego 0,125 mmol TRIS na litr (pH 6,8), 20 g dodecylosiarczanu sodu na litr, 5 procent glicerol (obj./obj.) i 5 mmol EDTA na litr.18. Intensywność optyczną fragmentów czynnika von Willebranda, po immunoblotach i autoradiografii, określono metodą densytometrii skaningowej.18 Różnica między intensywnością pasma 350 kd w Mieszanina reakcyjna bez EDTA i ta w mieszaninie z EDTA reprezentowała ilość wytworzoną przez proteazę w badanej próbce. Pasmo 350 kD generowane przez seryjnie rozcieńczone próbki plazmy kontrolnej, wyrażone jako procent wytworzonej w nierozcieńczonej próbce plazmy kontrolnej, wykazuje liniową korelację ze stężeniem w osoczu. Dlatego intensywność optyczną pasma 350 kD wygenerowanego w teście użyto do reprezentowania aktywności proteazy w badanej próbce.
Sześćdziesiąt siedem próbek osocza od osób kontrolnych i pacjentów z zakrzepową plamicą małopłytkową uzyskano na Uniwersytecie w Miami i losowo rozdzielono w sposób zaślepiony do laboratorium, w którym przeprowadzono test. Wiele próbek osocza zostało zamrożonych w -70 ° C. Analiza przechowywanych próbek osocza kontrolnego wykazała, że zamrażanie przez co najmniej 20 lat nie wpłynęło niekorzystnie na aktywność proteazy.
Przygotowanie IgG
IgG wyizolowano z osocza z kolumnami A-agarozowego białka gronkowcowego zrównoważonymi buforem 50 mmol TRIS na litr (pH 8,0) i 0,5 mol chlorku sodu na litr. IgG eluowano buforem o zawartości 0,1 mola glicyny na litr (pH 2,8) i 0,5 mola chlorku sodu na litr (pH 2,8). Eluaty, które natychmiast zobojętniono przez rozcieńczenie 1:10 TRIS (1 mol na litr, pH 8,0), poddano intensywnej dializie wobec buforu TRIS z roztworem soli, a następnie zatężono na glikolu polietylenowym 20 000. Stężenie białka oznaczano za pomocą testu wiązania barwnikiem brylantowo-błękitnym Coomassie.15 Jako referencję zastosowano globulinę odpornościową bydlęcą.
Wykrywanie inhibitora przez mieszanie badań
Do badań mieszania próbki osocza inkubowano w 56 ° C przez 60 minut w celu inaktywacji proteazy. Kontrolne osocze inkubowano następnie w 37 ° C przez 30 minut z równą objętością testowanego osocza lub IgG. Aktywność proteazy w mieszaninie wyrażono jako procent w osoczu kontrolnym inkubowanym z ogrzewanym kontrolnym osoczem lub kontrolnym IgG.
W badaniach neutralizacji IgG przeciwciało IgG inkubowano z różnymi stężeniami króliczych przeciwciał IgG przeciwko ludzkiemu regionowi Fab IgG lub regionowi Fc lub mułowi IgM (Sigma Chemical, St.
[patrz też: bromazepam, diltiazem, dekstran ]
[patrz też: pecherzyca, pekan, penire plus opinie ]