Skip to content

Proteazy czynnika von Willebranda w trombotycznej trombocytopenicznej Purpurze i zespole hemolityczno-mocznicowym cd

1 miesiąc ago

470 words

Po elektroforezie białka przeniesiono na błonę nitrocelulozową i wybarwiono za pomocą króliczych przeciwciał skoniugowanych z peroksydazą przeciwko ludzkiemu czynnikowi von Willebranda (P0226, Dako, Glostrup, Dania) .9 Połączoną próbkę cytrynowanego normalnego ludzkiego osocza, uzyskaną od 42 zdrowych mężczyzn i przechowywany w -70 ° C, został użyty do kalibracji testu proteazy. Każdą próbkę osocza oceniono co najmniej trzy razy pod kątem aktywności proteazy rozszczepiającej czynnik von Willebranda, a wyniki podano jako średnie procenty aktywności normalnego połączonego ludzkiego osocza. Próbki o poziomach aktywności przekraczających 50 procent wartości normalnego połączonego ludzkiego osocza zdefiniowano jako normalne. Przebadaliśmy próbki pod kątem inhibitora proteazy rozszczepiającej czynnik von Willebranda, mierząc aktywność proteazy w mieszaninie osocza od pacjentów i normalnego osocza w trzech rozcieńczeniach (4: 1, 1: i 1: 5) po 10-minutowej inkubacji w 37 ° C.12 Następnie oszacowano ilość aktywności proteazy zahamowanej o ml plazmy pacjentów; w ten sposób U inhibitora neutralizuje aktywność proteazy w ml normalnego ludzkiego osocza.
Trawienie proteolityczne czynnika von Willebranda z próbek osocza pacjenta oceniano za pomocą analizy multimerycznej po aktywacji proteazą i dializie, jak opisano powyżej, ale bez dodawania substratu czynnika von Willebranda wyizolowanego z prawidłowego ludzkiego osocza.
Aktywność proteazy rozszczepiającej czynnik von Willebranda określono również w komercyjnie przygotowanych próbkach świeżo mrożonego osocza inaktywowanego wirusem dostarczonego przez usługę Blood Transfusion Service (Swiss Red Cross, Bern, Szwajcaria) i Octapharma (Wiedeń, Austria). W sześciu różnych partiach ze Szwajcarskiego Czerwonego Krzyża wirus został unieczynniony przez ekspozycję na światło w obecności błękitu metylenowego, a następnie filtrację w sterylnych warunkach z użyciem filtrów LeukoVir (HemaSure, Marlborough, MA), podczas gdy sześć partii od Octapharma było leczonych z procedurą rozpuszczalnik-detergent.
Chromatografię powinowactwa IgG przeprowadzono na 5-ml kolumnie A-Sepharose z białkiem A (Pharmacia LKB), jak opisano poprzednio. Zastosowaliśmy próbki osocza do kolumny, która została zrównoważona 0,15 molami chlorku sodu na litr i 10 mmolami TRIS na litr (pH 7,4). Białka osocza eluowano 0,15 molami chlorku sodu na litr i 10 mmolami TRIS na litr (pH 7,4), a następnie 0,1 mola cytrynianu sodu na litr (pH 4,0). Inhibitor proteazy rozszczepiającej czynnik von Willebranda badano w niezwiązanej frakcji próbek osocza, jak również we frakcji IgG eluowanej przy pH 4,0 po dializie wobec 0,15 mola chlorku sodu na litr i 10 mmol TRIS na litr (pH 7,4). ).
Wyniki
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka kliniczna pacjentów. 53 pacjentów z mikroangiopatią zakrzepową, którzy byli włączeni do badania podzielono na dwie grupy (Tabela 1): 37 pacjentów bez rodzinnej historii zaburzenia sklasyfikowano jako mających niezwiązaną z zakrzepową plamkę małopłytkową zakrzepową lub zespół hemolityczno-mocznicowy, a 16 pacjentów z przynajmniej jeden dodatkowy dotknięty członek rodziny został sklasyfikowany jako mający rodzinną formę
[hasła pokrewne: dienogest, diklofenak, Choroba Perthesa ]
[hasła pokrewne: psychoterapia psychodynamiczna, pszczoła a osa, pszeniczny brzuch ]