Skip to content

polmed laryngolog

4 miesiące ago

484 words

Po przemyciu sekcje inkubowano następnie z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi, płukano i montowano; obrazy zostały przechwycone za pomocą mikroskopu konfokalnego Zeiss Pascal LSM5 w rdzeniu mikroskopowym UCSF. Obrazy analizowano w Photoshopie (Adobe Systems). Ludzkie zarodkowe komórki nerki 293 (HEK293) transfekowano 2 .g DNA (konstrukty fuzyjne PNKD-L), hodowano, utrwalano i sondowano odpowiednimi przeciwciałami stosując standardowy protokół (patrz Metody dodatkowe). Obrazy uzyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss Pascal LSM5 w ośrodku mikroskopii UCSF. Immunoblot komórek transfekowanych. Komórki HEK293 transfekowano 2 | jg DNA (konstrukty fuzyjne PNKD-L, -M i -S WT), hodowano i zebrano 36 godzin później, po transfekcji. Komórki HEK poddano działaniu ultradźwięków w 500 ul buforu RIPA z inhibitorami proteazy i fosfatazy; następnie homogenaty zastosowano do analizy Western blot inkubowanej z przeciwciałami PNKD i króliczym przeciwciałem anty-GFP (rozcieńczenie 1: 5000; Abcam). W doświadczeniach z rozdziałem fazy detergentowej zebrano surowe frakcje błonowe transfekowanych komórek HEK293. TX-114 dodano do surowych frakcji błonowych i inkubowano; Dwie warstwy (hydrofobowe i hydrofilowe) zebrano jak opisano (47, 48), a następnie zastosowano w analizach Western. Immunoblot tkanek mózgowych myszy. Metodą Western blotting homogenatów tkanek całego mózgu uzyskanych od myszy WT, transgenicznych i KO, przeprowadzono standardowymi technikami opisanymi w Dodatkowych Metodach. Poziomy Pnkd znormalizowano do a-tubuliny, stosując średnią intensywność pikseli dla immunoreaktywnych pasm na każdej ścieżce, a obrazy analizowano za pomocą oprogramowania NIH ImageJ. Prążki grzbietowe myszy (n = 8 / genotyp) zostały wypreparowane i szybko zamrożone w ciekłym azocie, a następnie poddane sonikacji w 300 .l buforu z inhibitorami proteazy i fosfatazy. Następnie bloty inkubowano z przeciwciałami skierowanymi przeciwko następującym białkom: VGLUT1, Rab3A, synaptofizyna, EAAT3, MAO-A, MAO-B, ADK, receptor adenozyny A1, COMT, synapsin-1, GAD65, GAD67, receptor adenozyny A2A, TH, DAT, receptory dopaminy D1A i D2 oraz VMAT2 (szczegóły w metodzie dodatkowej). Po wykryciu, bloty usuwano i reprombolizowano przeciwciałami przeciw dehydrogenazie 3-fosforanowej anty-tubuliny lub anty-gliceraldehydu. Poziom białka Striata normalizowano, a dane analizowano za pomocą testu Student. Mapowanie indukcji c-Fos po wytrąceniu ataku PNKD. W oparciu o testy pilotażowe dla przebiegu czasowego wybrano 2-godzinny punkt czasowy do badania immunoreaktywności c-Fos po wstrzyknięciu ip etanolu lub kofeiny. Myszy poddano perfuzji dosercowej w głębokim znieczuleniu alkoholowym 2,2,2-tribromoetanolem (Avertin), stosując standardowe protokoły. Skrawki mózgu inkubowano z pierwszorzędowymi i odpowiednimi przeciwciałami anty-cFos (patrz Metody dodatkowe). Obrazy rejestrowano za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse i kamery CCD lub mikroskopu Leica DM5000B z aparatem SPOT RT (SPOT diagnostic Inc.) i importowano do programu Photoshop w celu analizy. Badania neuroanatomiczne przeprowadzono w sposób zaślepiony. Wykrywanie amin biogennych w prążkowiu za pomocą HPLC. Myszy Pnkd, myszy z miotu WT, myszy Pnkd WT-Tg i myszy Pnkd-KO uśmiercano w warunkach podstawowych (10. 12 myszy na genotyp) lub 20 minut po podaniu ip kofeiny (25 mg / kg, 10. 12 myszy na genotyp). Striaty szybko usunięto, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze <80 ° C przed HPLC. Prążki grzbietowe homogenizowano w 100 750 750 .l 0,1 M TCA zawierającego 10 .M octanu sodu, 10 .M 4 EDTA i 10,5% metanolu (pH 3,8). Próbki wirowano w mikrowirówce przy 10 000 g przez 20 minut. Supernatant usunięto i przechowywano w temperaturze <80 ° C, a osad został zapisany do analizy białka [więcej w: picie oleju lnianego, psychoterapia psychodynamiczna, ph metria ]

0 thoughts on “polmed laryngolog”

  1. [..] Oznaczono ponizsze tresci z artykulu oryginalnego: Kolonoskopia w znieczuleniu[…]