Skip to content

laryngolog wrocław semaforowa

3 tygodnie ago

535 words

Po 5 tygodniach leczenia 2-AAA i po 6-godzinnym poście, każdej grupie myszy podano śródotrzewnowy test tolerancji glukozy (IPGTT); 1,5 mg / g masy ciała; 75 mg / ml roztworu glukozy lub ITT; 0,00075 U insuliny / g wagi ciała, 0,15 U / ml roztworu insuliny (Sigma-Aldrich). W przypadku IPGTT pobierano próbki krwi żylnej z żyły ogonowej bezpośrednio przed wstrzyknięciem glukozy, a następnie seryjnie po 30, 60 i 120 minutach od wstrzyknięcia. W przypadku ITT pobierano próbki krwi żylnej z żyły ogonowej bezpośrednio przed wstrzyknięciem insuliny, a następnie seryjnie po 15, 30, 45 i 60 minutach od wstrzyknięcia. Po zakończeniu badania, tkanki zebrano do analizy profilowania metabolitów. W celu homogenizacji wątroby i trzustki 25 mg próbki tkanki zmieszano z 250 .l roztworu 50:50 metanol / woda. W przypadku mięśnia szkieletowego 25 mg tkanki zmieszano z 250 ul wody HPLC (JT Baker). Wszystkie próbki tkanek następnie homogenizowano przez 4 minuty przy 25 Hz w TissueLyser II (QIAGEN). 200 ul otrzymanych homogenatów wyekstrahowano zmodyfikowaną metodą Bligh-Dyer (17), a uzyskaną fazę wodną wysuszono i odtworzono w metanolu, zawierającym znakowane standardy izotopowe (L-fenyloalanina-d8 i L-walina-d8) jako wykonywane z próbkami osocza. W przypadku pery-maradalnej tkanki tłuszczowej, metabolity ekstrahowano najpierw przez zmieszanie zebranych tkanek z 6 .l na mg tkanki tłuszczowej roztworu metanol / chloroform (2: obj./obj.). Wyekstrahowane tkanki tłuszczowe następnie homogenizowano przez 4 minuty przy 25 Hz w TissueLyser II. Otrzymane homogenaty zmieszano z chloroformem i wodą (2 ul na mg tkanki tłuszczowej dla każdego rozpuszczalnika) i odwirowano przy 10 000 g przez 20 minut w 4 ° C. Górne warstwy wodne wysuszono i odtworzono w roztworze metanolowym zawierającym znakowane wzorce (L-fenyloalanina-d8 i L-walina-d8), jak opisano wcześniej (26). Krzywą kalibracyjną z użyciem 2-AAA d3 (Izotopy C / D / N Inc.) wygenerowano dla bezwzględnego oznaczenia ilościowego 2-AAA w próbkach osocza i tkanek. Analizy LC-MS / MS przeprowadzono następnie stosując tę samą metodologię jak opisano powyżej dla ludzkiego osocza. Eksperyment wydzielania insuliny komórki BTC6. Te komórki są ustalonym modelem do badania wydzielania insuliny. Komórki BTC6 zastosowano w pasażu o numerze 4 a7, hodowano w DMEM (2002-30; ATCC), 15% FBS, z penicyliną / streptomycyną (100 IU / ml / 100 ug / ml). Komórki umieszczono na 24-studzienkowych płytkach kolagenowych przy 40 000 komórek na dołek i inkubowano z 2-AAA w różnych stężeniach w zakresie od 0 do 100. M przez 0 do 72 godzin. W dniu eksperymentu komórki płukano PBS, a pożywkę zmieniono na DMEM bez FBS lub glukozy, do której dodano 0,1% BSA. Po godzinie inkubacji tę pożywkę zmieniono na pożywkę bez surowicy zawierającą 2,5 mM lub 5,0 mM glukozy, jak wskazano. Wytwarzanie insuliny mierzono w supernatancie po dodatkowej godzinie inkubacji. Aby ocenić zależność czasową, 2-AAA dodano do komórek po wysianiu na kolagen i inkubowano przez 0,5, 2, 6 i 72 godziny. Mysie wysepki. Przeprowadzono również badania w mysich wysepkach izolowanych od samców myszy C57BL / 6J, jak opisano wcześniej (27). Wysepki uzyskano przez trawienie trzustki kolagenazą, oczyszczono gradientem gęstości Ficoll, starannie wyselekcjonowano, a następnie hodowano przez 24 godziny. W doświadczeniach z wydzielaniem insuliny, 15 wysp umieszczano w każdej probówce do mikrowirówki i inkubowano w buforze wydzielającym wysepki zawierającym 120 mmol / l NaCl, 5 mmol / l KCl, mmol / l CaCl2, 1,2 mmol / l MgCl2, 24 mmol / l NaHCO3, 10 mmol / l HEPES i 2,5 mmol / l glukozy, barbotowane z 95% O2 / 5% CO2 i uzupełnione 0,5% (wag./obj.) BSA
[podobne: przetoka zębowa, pszczoła a osa, psychoterapia psychodynamiczna ]