Skip to content

echo serca kielce cena

3 tygodnie ago

154 words

(B) Wpływ PON1 na aktywność peroksydazy w teście TMB MPO lub HRP. (C) Wpływ na oznaczenie TMB PON1 (650 nM), HDL (650 nM) lub obu na aktywność MPO (65 nM) peroksydazy. (D i E) Ludzkie granulocyty obojętnochłonne izolowane od zdrowych dawców (PMNWT) lub osobników z niedoborem MPO (PMNMPO .) inkubowano w 37 ° C w 50% surowicy przez godzinę pod nieobecność lub w obecności 13-octanu 12-mirystynian forbolu ( PMA) i MPO lub PON1, jak wskazano. Endogenne surowicze kwas arachidonowy (AA), kwas linolowy (LA), 9-HODE i 9-HETE następnie określono ilościowo przez stabilne rozcieńczenie izotopowe LC / MS / MS, jak opisano w Methods. (F) PON1, MPO / H2O2, żadne lub oba nie zostały dodane do 50% surowicy, inkubowane w 37 ° C przez godzinę, a następnie AA, LA lub wskazane produkty utleniania zostały określone ilościowo, jak opisano w Metodach. Przedstawione dane reprezentują średnią. SD trzech powtórzeń. * P <0,05; ** P <0,001. NA, bez żadnych dodatków; oxFA, utlenione kwasy tłuszczowe. Następnie próbowaliśmy sprawdzić, czy PON1 może wpływać na aktywność katalityczną MPO. Dodanie PON1 do MPO zahamowało aktywność peroksydazy o około 50% (Figura 1B). Wpływ PON1 na aktywność peroksydazy MPO był swoisty, ponieważ zastąpienie MPO alternatywną peroksydazą hemową, HRP (ale te same poziomy H2O2 i substratu chromoforu), nie wykazało wpływu PON1 na aktywność peroksydazy (Figura 1B). Co ciekawe, dodanie HDL do MPO dało powtarzalny, umiarkowany wzrost aktywności peroksydazy MPO; jednak dodanie PON1 w obecności HDL nadal powodowało zmniejszenie aktywności peroksydazy MPO o około 50% (Figura 1C). W celu dalszego zbadania fizjologicznego znaczenia interakcji MPO-PON1, przeprowadzono dodatkowe badania. Wcześniej używaliśmy izolowanych ludzkich neutrofili od pacjentów zdrowych i z niedoborem MPO, aby pokazać, że aktywacja neutrofili w osoczu lub surowicy jest fizjologicznym mechanizmem inicjacji peroksydacji lipidów, takich jak w miejscach ostrego zapalenia, poprzez mechanizm wymagający MPO (33). W związku z tym zbadaliśmy wpływ PON1 na peroksydację lipidów ludzkich zależną od neutrofili w surowicy, monitorowaną za pomocą tandemowej spektrometrii masowej izotopowej chromatografii cieczowej (LC / MS / MS) produktów oksydacji arachidonowej (np. Heterów kwasu hydroksyeicosatetraenowego) i kwasy linolowe (np. kwas hydroksyoktadekadienowy [HODEs]). Zgodnie z oczekiwaniem dodanie neutrofilów z normalnych ochotników (PMNWT) do surowicy nie sprzyjało peroksydacji lipidów w warunkach podstawowych, ale nastąpiło to po aktywacji neutrofili przez dodanie agonisty estru forbolu (Figura 1D). Jako dodatkową kontrolę, aby wykazać, że monitorowana peroksydacja lipidów była przypisana do uwalniania MPO z PMN, przeprowadzono równoległe badania z użyciem neutrofili wyizolowanych od osobnika z niedoborem MPO (PMNMPO .), wykazując brak tworzenia 9-HETE (wolny rodnik. specyficzny produkt utleniania kwasu arachidonowego) po dodaniu agonisty estru forbolu, ale zaznaczono tworzenie 9-HETE po dodaniu katalitycznych poziomów MPO do aktywowanego PMNMPO. (Figura 1D). Dodanie PON1 do surowicy w obecności spoczynkowego PMNWT nie spowodowało zmian w poziomach 9-HODE lub 9-HETE, ale znacząco osłabiło przyrosty przyrostów produktów peroksydacji lipidów wytworzonych podczas stymulacji PMNWT (Figura 1E). W równoległym zestawie badań, bezpośredni wpływ PON1 na zakres katalizowanego MPO tworzenia wielu różnych rodzajów cząsteczek HETE i HODE w surowicy określono przez stabilne rozcieńczenie izotopowe LC / MS / MS. Ponownie, dodanie PON1 znacznie osłabiło zależne od MPO inicjowanie peroksydacji lipidów i tworzenie różnych HETE i HODE z endogennych lipidów w surowicy (Figura 1F). Łącznie, wyniki te wskazują, że w fizjologicznej macierzy, takiej jak osocze lub surowica, MPO i PON1 mogą wchodzić w interakcje ze sobą i modulować aktywność każdego z nich. MPO i PON1 wpływają na wzajemną aktywność in vivo [więcej w: przewlekła niewydolność żylna, przetoka zębowa, pęcherzowe oddzielanie się naskórka ]